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膜分析儀應用：膽固醇對 hBest1/POPC 和 hBest1/SM Langmuir 單分子層的
來源： 瀏覽 1054 次 發布時間:2024-06-03
Bestrophin-1(hBest1)是一種跨膜蛋白，在視網膜色素上皮(RPE)細胞和神經元細胞的基底外側膜上表達。hBest1的主要功能之一是氯離子的鈣依賴性運輸。它還被認為在中樞神經系統中發揮通道作用，參與神經膠質細胞中γ-氨基丁酸(GABA)和星形膠質細胞和神經元中谷氨酸(Glu)的轉運。BEST1基因的突變（表現在合成的蛋白質中）是導致視網膜疾病發展的原因，稱為Bestrophinopathies。關于hBest1與不同細胞膜脂質的分子相互作用的科學數據不足以闡明蛋白質的功能活性，尤其是與膽固醇(Chol)，它在“經典”脂筏的形成中起關鍵作用。膽固醇的主要物理化學性質之一是其凝聚作用。Chol與卵磷脂的相互作用導致脂肪酸烴殘基的構象變化和“干擾”減少，它們的方向轉向分子的中心軸，自由體積和橫截面減少，以及在不改變表面壓力的情況下被分子占據的區域。當與某些類型的多不飽和磷脂相互作用時，膽固醇沒有凝聚作用。
在這項研究中，特別關注Chol與hBest1在純和復合蛋白質-脂質模型系統中的相互作用。使用朗繆爾單層膜進行表面壓力測量和布魯斯特角顯微鏡成像，我們證明了Chol對純hBest1單層膜的凝聚效應可以忽略不計，在Ca 2+離子存在下會變得更高。
Kibron膜分析儀的的應用
PTFE涂層的不銹鋼多孔板（孔容量0.5 mL）和Wilhelmy測力探頭的Langmuir天平（Kibron Inc）在相同的實驗條件下進行實驗，溫度為35±2°C。單層在含有150 mM NaCl(pH~7)的亞相上形成，添加和不添加0.5μM CaCl 2。將單層的成分連續應用于界面.首先將POPC或雞蛋SM（氯仿中的1 mM儲備溶液）涂抹至表面壓力π達到20 mN/m，然后添加Chol（氯仿中的0.1 mM儲備溶液）2分鐘后，摩爾分數X Chol0.167 0.285、0.375、0.444或0.5。再過2分鐘后，當溶劑蒸發且π達到恒定值時，將hBest1（在150 mM NaCl中的1 mg/mL儲備溶液）添加到二元POPC/Chol或SM/Chol單分子層中。擴散hBest1的體積是相對于系統中的主要脂質（POPC或SM）計算的，摩爾比分別為1:45和1:86，因此蛋白質所占的面積與周圍脂質所占的面積為1:3。在將hBest1應用到界面上10分鐘后進行測量。每個實驗至少進行七次.
實驗結果
單分子層膜中膽固醇的濃度會影響膜蛋白的許多物理化學、生化和生物物理特性。對于Na+K+ATPase——Chol濃度顯示出調節作用——在膜中低至中等水平的膽固醇（膽固醇：磷脂的比例從1:4到1:2）時，活性增加，而在較高水平膽固醇濃度（膽固醇：磷脂比，1:1）酶活性降低。視紫紅質的功能還取決于膽固醇的存在。高濃度的膽固醇導致層增厚和視紫紅質無法改變其構象，這是其功能所必需的。研究結果證明了膽固醇對hBest1和復合hBest1薄膜的凝聚作用。在POPC/Chol/hBest1和SM/Chol/hBest1三元單分子層中，冷凝效應發生在不同膽固醇濃度下。這也表明Ca 2+離子在膽固醇凝聚效應中起關鍵作用——對于hBest1/Chol和hBest1/SM/Chol單分子層非常明顯。
圖1.膽固醇對(A)hBest1、(B)hBest1/POPC、(C)hBest1/SM、(D)POPC和(E)SM單分子層的凝聚效應（Chol的摩爾分數為0.167；0.285；0.375；0.444和0.5)在存在或不存在Ca 2+的情況下，在35±2°C。數據表示為平均值±SE，n=7。
圖2.(A)hBest1/Chol單分子層、(B)hBest1/POPC/Chol(C)hBest1/SM/Chol單分子層的BAM圖像（摩爾分數為Chol 0.167；0.285；0.375；0.444和0.5）Ca 2+的存在與否，在35±2°C。白色比例尺=100μm。
圖3、(A)POPC/Chol單層膜，(B)SM/Chol單層膜的BAM圖像(Chol摩爾比為0.167;0.285;0.375;0.444和0.5)，存在或不存在Ca2+，在35±2°C。白色比例尺=100?m。
總結
bestrophin-1蛋白(hBest1)是一種跨膜通道，與視網膜色素上皮中氯離子的鈣依賴性轉運以及神經細胞中谷氨酸和GABA的轉運有關。hBest1、鞘磷脂、磷脂酰膽堿和膽固醇之間的相互作用對于hBest1與細胞膜結構域及其生物學功能的關聯至關重要。由于膽固醇在脂筏的形成、脂質的運動排序和側膜結構的建模/重塑中起關鍵作用，研究人員應用LB單分子層膜技術（Kibron膜分析儀）檢查了不同膽固醇濃度對hBest1/POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)和hBest1/SM Langmuir單分子層在存在/不存在Ca 2+的情況下離子使用表面壓力測量和布魯斯特角顯微鏡研究。研究人員使用朗繆爾單層膜（Kibron）進行表面壓力測量和布魯斯特角顯微鏡成像，研究證明了Chol對純hBest1單層膜的凝聚效應可以忽略不計，在Ca 2+離子存在下會變得更高。在不存在Ca 2+的情況下，Chol對復合hBest1/POPC和hBest1/SM單分子層也表現出顯著的凝聚效應，在添加Ca 2+離子后會有所不同。研究結果揭示了表面單層平面中hBest1分子的組織和結構構象的Chol作用，以了解蛋白質與細胞膜結構域的關聯，這一過程可能會影響其生物學功能。