2結果與討論

2.1膠原蛋白肽的制備

完整的膠原是具有三螺旋結構的原膠原分子，形成獨特的纖維結構，交織成堅固的網絡，提供結締組織的承受力。這樣的膠原是難以溶解的，也無法覆層至羥基磷灰石材料表面，因此必須對其進行降解，為覆層提供材料。

為實現膠原蛋白肽分子量可控均一，分別比較了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶的酶解效果，在酶本身最適pH條件下，酶解至分子量不發生明顯變化，檢測其酶解后分子量分布(分子量計算依據圖1中的標準曲線)，結果見表1。從表中結果可以看出不同的酶對膠原蛋白的酶解效果不盡相同，然而均未能達到控制其分子量在200~5 000 Da的預期效果。胰蛋白酶酶解速度最快，1 h酶解結束，而堿性蛋白酶是這幾種蛋白酶中酶解后分子量最小的。因此，將這2種最適pH為8.0的蛋白酶混合，經條件優化發現胰蛋白酶。堿性蛋白酶為2:5時，2種酶同時作用可以在1 h內將膠原蛋白酶解至200~5 000 Da(凝膠過濾色譜檢測結果見圖2)。堿性蛋白酶酶切位點為Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Try，胰蛋白酶酶切位點為Arg、Lys，這2種酶的酶切位點無重疊，從而在酶解過程中協同作用，實現了快速高效酶解。

圖1多肽分子量計算標準曲線

圖2膠原蛋白肽凝膠過濾色譜分析

表1酶解效果表

2.2膠原蛋白肽LB膜的制備

用LB膜分析儀研究了膠原蛋白肽LB膜的表面壓-面積曲線，如圖3所示。當膠原蛋白肽氯仿溶液被滴加在亞相表面上，隨著氯仿在亞相表面的鋪散，膠原蛋白肽呈分散狀態，分子間距較遠，單分子所占面積大，呈現出LB膜制備過程中氣相狀態特點，表面壓幾乎為零。在氯仿溶劑揮發干凈后，隨著滑障的壓縮膠原蛋白肽分子互相靠近，單分子所占面積變小，當分子間距離縮短至液相狀態，可以檢測到表面壓開始緩緩上升。繼續壓縮，亞相表面上的膠原蛋白分子由液態向固態轉變，分子間距快速減小，表面壓快速上升，此時形成固相狀態的單分子膜，分子之間排列緊密。繼續壓縮，可以使分子間距到達最小值，表面壓升至最高，即為其崩潰壓力，再壓縮則形成的單分子層會瞬間崩潰。經圖3結果中可以看出，膠原蛋白肽的成膜過程符合標準朗格繆爾膜成膜過程的相關特性，其崩潰壓力為23.8 mN/m，維持表面壓為23 mN/m，可以得到穩定的膠原蛋白肽單分子層，實現LB膜的固相轉移，制備膠原蛋白肽覆層羥基磷灰石材料。

圖3面積-表面壓圖像

2.3覆層羥基磷灰石材料性能研究

2.3.1 AFM表征

利用AFM對膠原蛋白肽覆層羥基磷灰石材料性質進行研究(結果見圖4)。從圖4中的AFM 3D圖像中可以看出轉移至羥基磷灰石表面上的膠原蛋白肽LB膜性質良好，形成的單分子層呈平鋪狀態，分子分散均勻，厚度相對均勻，經估算單層厚度約為3.1 nm，2層厚度為5.7 nm，3層為8.9 nm，4層為11.7 nm。通過軟件測得單層膠原蛋白肽LB膜表面粗糙度Ra(輪廓算術平均偏差)為0.9 nm，表明膜的表雖不完全平坦，但相對均勻。這表明通過LB膜技術可以制備出膠原蛋白肽覆層的羥基磷灰石材料，并且可以根據需求制備單層、雙層、多層的覆層材料，滿足不同應用需求。

圖4空白羥基磷灰石材料與覆層材料AFM 3D圖像

2.3.2材料穩定性

通過用生理鹽水對材料進行浸泡、多次沖洗，檢測覆層4層羥基磷灰石材料中膠原蛋白肽的泄露，來評價生物覆層材料的穩定性。對收集的浸泡液、沖洗液濃縮100倍，通過微量Lowry法檢測其蛋白濃度，在浸泡液中未檢出膠原蛋白肽，沖洗液檢測結果見表2。從表中結果可以看出隨著沖洗次數增多，泄露的膠原蛋白肽呈現先增加后減少的趨勢，說明覆層的膠原蛋白肽會有一定的脫落，但不會一直脫落，經折算，脫落膠原蛋白肽總量僅占覆層總量的0.01%，因此制備的覆層材料是穩定可靠的。

表2沖洗液檢測結果表

2.3.3力學性能

對羥基磷灰石和覆層材料的楊氏模量進行了測量，結果如圖5所示。空白的羥基磷灰石材料的楊氏模量為3.14±0.16 MPa，隨著覆層層數的增加楊氏模量逐漸增加，最高可達6.21±0.18 MPa，說明膠原蛋白肽的覆層能夠有效地改善羥基磷灰石材料的力學性能，提高其楊氏模量。

圖5不同材料的楊氏模量

2.3.4生物性能

MC3T3-E1細胞在羥基磷灰石和覆層材料上培養5天的增殖情況見圖6。因結果類似，圖中僅列出了單層和4層覆層材料的增殖結果，可以看出在覆層材料上MC3T3-E1細胞增殖要優于空白羥基磷灰石材料，表明所制覆層材料不僅無細胞毒性，而且因膠原蛋白肽的優良生物相容性，能一定程度上促進細胞增殖。所用的羥基磷灰石和膠原蛋白肽都是經過實踐證明的生物相容性良好的材料，其對材料生物性能的提升作用是由其本身的生物相容性良好引起的，因此覆層層數對生物性能提升作用不明顯。

圖6不同材料細胞培養情況

3結論

1)本文建立了一種制備膠原蛋白肽覆層材料的新方法，利用LB膜技術將膠原蛋白肽覆層至羥基磷灰石上，制備了一種新型覆層生物材料。

2)通過堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合作用實現了均一分子量膠原蛋白肽的制備。將膠原蛋白肽覆層至羥基磷灰石片上，通過AFM表征發現膜的表面平整，單層厚度約為3.1 nm。

3)制備的材料性能穩定，能有效提高羥基磷灰石材料的力學性能，生物相容性良好，能促進細胞增殖。進一步可以通過化學交聯提高覆層的穩定性，為新型醫用生物材料開發提供借鑒。