摘要

本文首次描述了一種與磷脂質(zhì)相關(guān)的高通量熒光。陰離子兩親磷脂可以在水溶液中形成復合物，其臨界膠束濃度(CMC)可以使用熒光探針N,N-二甲基-6-丙酰-2-萘胺(Prodan)測定。在與候選藥物相互作用時，由于脂質(zhì)和候選藥物之間的關(guān)聯(lián)，該CMC可能會轉(zhuǎn)變?yōu)檩^低的值，相互作用越強，轉(zhuǎn)變越大。藥物的代謝可以根據(jù)代謝速率和代謝物的性質(zhì)改變磷脂質(zhì)的程度。我們使用這種熒光方法從45種藥物和10種藥物的代謝物獲得的數(shù)據(jù)證明了與人體研究、體內(nèi)測試和細胞分析報告的磷脂沉積癥有良好的相關(guān)性。因此，該測定提供了一種快速、可靠且具有成本效益的篩選工具，用于早期預測候選藥物的磷脂沉積誘導潛力。

藥物誘導的磷脂病(PLD)，雖然不這么叫，但在1948年Nelson和Fitzhugh首次報道了長期服用氯喹的大鼠的泡沫巨噬細胞。1后來的研究表明，陽離子兩親藥物（CADs)負責誘導細胞中的這種脂質(zhì)積累，并導致存在主要成分為溶酶體的層狀包涵體。2-5 PLD背后的機制尚不完全清楚。兩個主要假設包括(i)CAD和磷脂之間通過疏水和靜電相互作用結(jié)合，導致溶酶體磷脂酶無法消化藥物脂質(zhì)復合物，以及(ii)CAD直接抑制脂質(zhì)消化酶。3，6-9沒有明確的證據(jù)表明藥物誘導的PLD與細胞毒性有關(guān)。這種脂質(zhì)儲存障礙被認為是細胞對CAD暴露的適應性反應10而不是毒理學表現(xiàn)，并且在給藥終止后是可逆的。11,12由PLD引起的脂質(zhì)代謝改變值得關(guān)注，因為它可能發(fā)生在包括肺、肝、腦、神經(jīng)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)在內(nèi)的一系列組織類型。13在某些情況下，它會導致藥物和/或其代謝物在層狀體中積累高達毫摩爾濃度并導致細胞損傷。2,14因此，研究了化合物對PLD可逆性的程度和持續(xù)時間，以評估其安全范圍。在PLD的診斷中，需要通過透射電子顯微鏡(TEM)進行確認，這被廣泛接受為表征藥物誘導的脂質(zhì)沉積的標準方法。9,15-18在TEM下，巨噬細胞中的洋蔥樣溶酶體是PLD的特征。然而，由于TEM成本高、需要犧牲實驗動物，以及研究與研究在實驗設計、劑量等方面的差異，TEM既不常見，也不容易滿足早期藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的要求。已經(jīng)開發(fā)了諸如計算機評估、體外生物篩選和體內(nèi)生物標志物等工具來滿足藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)不同階段的需求，以預測或識別磷脂質(zhì)沉積癥。由于CAD的特性，PLD的計算機模擬預測模型側(cè)重于篩選候選物的親脂性及其在中性13,19或較低pH值下的電荷，代表溶酶體中的條件。20后來的模型還包含詳細的化合物結(jié)構(gòu)信息13或藥代動力學特性以提高可預測性。10雖然可用作第一層標記工具，但計算機模型應謹慎使用，因為它們可能會投影PLD快照，尤其是對于虛擬分子，而不是完整的機械評估，包括劑量依賴性和時間依賴性。此外，這些工具無法預測非CAD誘導劑，例如高度親水的慶大霉素。21

圖1.用在不同檢測日期獲得的不同測試物品的平均CMC說明檢測的重現(xiàn)性。誤差棒代表標準偏差。

在大多數(shù)制藥公司的PLD篩選策略中，下一級篩選分析是基于細胞的生物分析，在細胞內(nèi)使用熒光脂質(zhì)或親脂性染料。22-25最近報道了一種基于96孔的基因表達分析26；然而，該測定已被證明不太敏感。22直到最近，還沒有基于非細胞的體外篩選測定可用。已經(jīng)報道了一種高通量langmuir-balance方法，將用測試化合物處理后臨界膠束濃度(CMC)的變化與在人類、動物和細胞中觀察到的PLD聯(lián)系起來。27這種方法大大提高了預測質(zhì)量與計算模型相比，與細胞分析和動物模型相比，增加了吞吐量；然而，這種方法需要使用專門的設備，即八通道表面張力計（Delta 8，Kibron Inc.，Helsinki，F(xiàn)inland），這在大多數(shù)實驗室中并不容易獲得。

在本報告中，我們描述了一種用于測定CMC的替代方法，因此與langmuir平衡方法相一致，藥物的磷脂生成潛力。我們使用熒光染料探針通過短鏈脂質(zhì)的CMC變化來測量藥物脂質(zhì)復合物的形成。一些熒光染料探針長期以來一直用于測定CMC，28,29包括脂質(zhì)30,31，這是基于影響染料探針熒光發(fā)射的膠束形成后的微環(huán)境變化。所需的儀器是大多數(shù)生物學和生物化學實驗室都有的熒光讀板儀。

藥物代謝至少可以通過兩種方式影響PLD。當形成CAD的極性代謝物時，它可以迅速排出體外，從而減少母體積累的可能性。另一方面，來自非CAD母體的陽離子兩親代謝物的形成也可以誘導PLD。32這種機制見解可能有助于解釋體外篩選結(jié)果與體內(nèi)動物數(shù)據(jù)之間的脫節(jié)。出于這個原因，我們還研究了一些測試化合物的主要代謝物的磷脂生成潛力。

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——摘要

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——方法

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——結(jié)果

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——討論